在模拟太空微重力环境下培养小鼠脑类器官，需结合微重力培养系统与传统脑类器官培养技术，通过优化诱导、分化及动态培养条件，提升类器官的成熟度与生理相关性。以下为具体培养方法及要点：

一、培养流程

1.诱导拟胚体（EB）形成

当人多能性干细胞（ESCs/iPSCs）在6孔板中长到融合度为70%~80%时，用于诱导EB。

用无钙镁的D-PBS洗涤细胞后，加入含0.5mM EDTA的无钙镁D-PBS溶液，轻柔吸出EDTA溶液，加入Accutase酶解细胞。

用mTeSR1培养基吹散克隆，转移至15ml离心管中，离心后重悬细胞于含ROCK抑制剂Y-27632的低bFGF ESCs培养基中。

将细胞悬液放入96孔板中，置于培养箱继续培养，24小时后可见有清晰边缘的小EB形成。

2.早期胚层分化

隔天轻柔地吸去半量培养基，补充新鲜培养基，培养基中添加Y-27632和FGF-2，直到EB直径大于350~450μm为止。

当EB直径达到350~600μm时，改用无添加剂的培养基继续培养。

3.原始神经上皮的诱导

当EB直径达到500~600μm且边缘光滑、透亮度显著增加时，将其转移至低吸附24孔板中，加入神经诱导培养基。

48小时后补加神经诱导培养基，继续培养4~5天，直至神经外胚层分化特征显现，假复层上皮呈现放射状结构。

4.Matrigel包埋与静态培养

将神经外胚层组织转移至Matrigel液滴中，进行包埋。

将包埋好的组织置于培养箱中静态培养，观察组织形态变化。

5.动态培养（模拟微重力环境）

使用微重力培养系统（如北京基尔比生物公司研制生产的Rotary Cell Culture System），将静态培养后的类器官转移至旋转生物反应器中。

加入含维生素A的脑类器官分化培养基，将生物反应器置于磁力搅拌平台或培养箱内轨道摇床上进行动态培养。

动态培养过程中，每3~4天更换培养基，全程监控类器官形态发育。

二、微重力环境对小鼠脑类器官培养的影响

1.促进三维结构形成：微重力环境通过降低流体剪切力和重力沉降效应，使细胞在悬浮状态下自由组装，形成更接近真实大脑的三维立体结构。

2.提升神经血管单元构建能力：微重力环境可促进多种细胞类型的共培养，如诱导血管内皮细胞与神经祖细胞自发形成“神经血管单元”，模拟血脑屏障的结构和功能。

3.增强电生理功能：研究表明，微重力环境下培养的脑类器官中，神经元网络的电活动更活跃，且能形成功能性突触连接，接近胎儿大脑的发育水平。

4.优化发育过程力学调控：微重力系统通过调节培养参数（如旋转速度），可模拟胚胎神经管形成时的低剪切力环境，促进神经上皮细胞的极化和神经管样结构的生成。

三、培养过程中的注意事项

1.细胞状态监测：在培养过程中，需定期观察细胞和类器官的形态变化，确保培养条件的适宜性。

2.培养基更换：根据培养体系的不同，定期更换培养基以维持营养供应和代谢废物清除。

3.避免机械应力干扰：传统搅拌式培养易产生较强的机械应力，可能损伤脆弱的神经前体细胞。微重力培养通过温和的流体运动传递营养和信号分子，避免机械损伤。

4.标准化培养条件：微重力培养系统可精确控制温度、气体浓度、流体动力学等参数，减少批次间差异，提升类器官的一致性。