在悬浮细胞（如淋巴细胞、肿瘤悬浮细胞、CHO 工程细胞）的体外培养与实验研究中，死细胞的积累是常见问题。死细胞会释放核酸酶、蛋白酶等有害物质，破坏培养基成分、引发活细胞凋亡，同时其碎片会干扰流式检测、细胞分选、蛋白纯化等后续实验，导致数据偏差或实验失败。因此，高效、温和地去除悬浮细胞中的死细胞，是保障细胞培养质量与实验准确性的关键技术环节。目前主流去除技术基于 “活细胞与死细胞的物理特性差异（密度、大小、沉降速率）” 或 “分子标志物差异” 设计，需根据细胞类型、样本量及实验需求选择适配方案。

一、基于物理特性的死细胞去除技术：温和高效的常规选择

悬浮细胞中活细胞与死细胞的物理特性差异（如密度、体积、变形能力）是物理去除方法的核心依据，这类技术操作简便、对细胞损伤小，适合常规实验室场景。

1. 密度梯度离心法：基于密度差异的精准分层

密度梯度离心是最常用的方法之一，其原理是利用梯度介质（如 Ficoll-Paque、Percoll、OptiPrep）构建连续或不连续密度梯度，通过离心力使活细胞与死细胞因密度不同在梯度中处于不同分层，从而实现分离。

操作要点：需根据目标细胞密度选择梯度介质 —— 例如分离人外周血淋巴细胞时，常用密度 1.077g/mL 的 Ficoll-Paque 溶液，活淋巴细胞密度略低于该值，会浮于梯度液上层，而死细胞、红细胞密度更高，沉于梯度液下层或管底；培养的肿瘤悬浮细胞（如 Jurkat 细胞、K562 细胞）密度通常为 1.050-1.060g/mL，可选用 Percoll（可自主调节密度）构建 1.040-1.070g/mL 的不连续梯度，通过 300-400×g 离心 15-20 分钟（室温或 4℃，避免高温损伤细胞），活细胞会富集于 1.050-1.060g/mL 的界面层。

优缺点：优点是回收率高（活细胞回收率可达 80%-90%）、纯度高（死细胞去除率＞95%），且梯度介质（如 Percoll）渗透压与细胞内环境接近，对活细胞损伤小；缺点是需优化梯度密度与离心参数，操作时间较长（约 30-60 分钟），不适合超大量样本（如 10¹⁰以上细胞）的快速处理。

2. 低速离心沉降法：基于沉降速率的简易分离

低速离心沉降法利用活细胞与死细胞的沉降速率差异（活细胞形态完整、密度均匀，沉降速率较死细胞更稳定），通过控制离心力与时间实现分离，适合对纯度要求不高、样本量较大的场景（如大规模 CHO 细胞培养）。

操作要点：将细胞悬液（浓度 1×10⁶-1×10⁷ cells/mL）置于离心管中，以 50-100×g 低速离心 5-8 分钟 —— 此时活细胞因沉降速率较快，会部分沉淀于管底，而死细胞（多为肿胀或破裂状态，密度低）多悬浮于上清液中；小心吸取上层 1/3-1/2 上清液丢弃（含大量死细胞），保留管底活细胞，用新鲜培养基重悬后即可。若需提高纯度，可重复操作 1-2 次，但需注意每次离心后活细胞回收率会下降 5%-10%。

优缺点：优点是操作极简便（无需特殊试剂）、耗时短（10-20 分钟）、成本低，适合应急处理；缺点是纯度较低（死细胞去除率仅 60%-70%），易因离心力过高导致活细胞沉淀不完全或损伤，需提前通过预实验确定最佳离心参数。

3. 过滤法：基于体积差异的快速筛选

过滤法利用活细胞与死细胞（及碎片）的体积差异，通过特定孔径的滤膜过滤细胞悬液，截留活细胞、去除小分子死细胞碎片，适合死细胞以碎片形式存在的场景（如细胞培养后期、冻融复苏后）。

操作要点：选择孔径略小于活细胞直径的滤膜（如淋巴细胞直径约 8-10μm，选 7μm 滤膜；肿瘤悬浮细胞直径约 12-15μm，选 10μm 滤膜），滤膜材质优先选用亲水性聚醚砜（PES）或尼龙，避免疏水性材质吸附细胞；将滤膜安装于过滤漏斗，用少量新鲜培养基湿润滤膜后，缓慢加入细胞悬液（流速＜1mL/min，避免压力过大损伤细胞），待过滤完成后，用 5-10mL 培养基冲洗滤膜 2-3 次，收集滤膜上截留的活细胞。

优缺点：优点是快速（5-10 分钟）、可处理大量样本，适合去除死细胞碎片；缺点是无法分离完整死细胞（若死细胞体积与活细胞接近），且滤膜可能吸附部分活细胞（吸附率通常＜5%），需提前检测滤膜对目标细胞的吸附性。

二、基于分子标志物的死细胞去除技术：高纯度分选的精准方案

当实验对活细胞纯度要求极高（如单细胞测序、细胞移植）时，需基于活细胞与死细胞的分子标志物差异（如细胞膜完整性、表面抗原）进行分选，核心技术包括免疫磁珠分选法与流式细胞术分选法。

1. 免疫磁珠分选法：基于细胞膜完整性的靶向去除

免疫磁珠分选法利用 “死细胞细胞膜破损，暴露胞内抗原（如磷脂酰丝氨酸外翻、DNA 片段）” 的特性，通过偶联特异性抗体的磁珠结合死细胞，再利用磁场分离死细胞与活细胞。

操作要点：常用靶向死细胞的抗体包括抗磷脂酰丝氨酸（Annexin V）抗体（死细胞早期膜外翻标志物）、抗单链 DNA（ssDNA）抗体（死细胞 DNA 降解标志物）；将细胞悬液与磁珠（如 10μL 磁珠 / 1×10⁶ cells）在 4℃避光孵育 10-15 分钟，期间轻柔混匀，避免磁珠聚集；将孵育后的细胞悬液加入磁场分离柱，死细胞因结合磁珠被截留于柱内，活细胞随洗脱液流出，收集洗脱液即可获得高纯度活细胞。

优缺点：优点是纯度极高（死细胞去除率＞98%）、特异性强，可同时去除完整死细胞与碎片；缺点是成本高（磁珠价格昂贵）、操作需严格控制温度与孵育时间（避免抗体非特异性结合），适合小样本（1×10⁵-1×10⁷ cells）的高纯度分选。

2. 流式细胞术分选法：多参数筛选的极致精准

流式细胞术分选法通过荧光染料标记死细胞，结合流式细胞仪的多参数检测（荧光信号、散射光信号），精准识别并分选活细胞，适合对细胞纯度与活性要求极高的实验（如干细胞培养、细胞功能检测）。

操作要点：常用死细胞荧光染料包括台盼蓝（无法进入活细胞，死细胞呈蓝色）、PI（碘化丙啶，仅进入死细胞与 DNA 结合，激发后发红色荧光）、7-AAD（死细胞特异性染料，发红色荧光，对活细胞毒性更低）；将细胞悬液与荧光染料（如 PI 终浓度 5μg/mL）在室温避光孵育 5-10 分钟，通过流式细胞仪检测 —— 活细胞因无荧光信号、散射光信号稳定（形态完整）被识别，死细胞因荧光阳性被排除，通过分选模块收集活细胞，分选后需用培养基洗涤 1-2 次去除残留染料。

优缺点：优点是纯度最高（活细胞纯度可达 99% 以上）、可同时分析细胞活性与表面标志物（如分选 CD4⁺T 活细胞）；缺点是设备昂贵（需流式分选仪）、操作复杂（需专业人员）、分选速度慢（每小时约 1×10⁶ cells），且高速分选可能对活细胞造成一定损伤（活性下降 5%-10%）。

三、关键操作注意事项与技术选择原则

无论选择哪种方法，均需注意以下核心要点以保障活细胞质量：

1.无菌操作：所有试剂（梯度介质、磁珠、滤膜）需无菌处理，操作过程在超净台内进行，避免污染；

2.温和处理：离心时避免过高转速（＞500×g），过滤时避免压力过大，孵育荧光染料或磁珠时避免剧烈振荡，减少活细胞损伤；

3.活性验证：去除死细胞后，需通过台盼蓝染色（活细胞拒染）或 MTT 法检测活细胞比例，确保活细胞活性＞90%（常规实验）或＞95%（精准实验）。

技术选择需遵循 “需求适配” 原则：

常规培养、样本量大、成本敏感：优先选低速离心沉降法或过滤法；

常规实验、对纯度有要求：选密度梯度离心法；

精准实验（如细胞移植、蛋白表达）、小样本：选免疫磁珠分选法；

极致纯度需求（如单细胞测序、干细胞研究）：选流式细胞术分选法。

悬浮细胞中死细胞的有效去除，是保障细胞培养稳定性与实验可靠性的基础。不同技术各有优劣，需结合细胞类型、实验目的与样本特征灵活选择，同时通过规范操作减少活细胞损伤，最终实现 “高效去除死细胞、最大保留活细胞活性” 的目标，为后续细胞功能研究、药物筛选或产业化生产提供高质量细胞原料。