体外培养膀胱癌类器官的方法主要包括以下步骤：

一、制作气液交互培养系统

在Transwell上室内的多孔培养膜表面制作均匀平铺的鼠尾胶原支撑层。

用鼠尾胶原溶液重悬新鲜离体的膀胱癌组织，并在混匀后一起加到鼠尾胶原支撑层上，然后放入37℃培养箱使其凝固，制得包含膀胱癌组织的鼠尾胶原层。

二、配制培养基并加入

在Transwell下室内加入类器官培养基，并使培养基液面低于包含膀胱癌组织的鼠尾胶原层。类器官培养基的组成通常包括多种生长因子、激素、营养物质以及抑制剂等，以支持膀胱癌细胞的生长和分化。

三、传代与冻存

在首次种入样本2天后，进行传代操作。将含类器官的鼠尾胶原移入细胞消化液中，置于37℃摇床内孵育一段时间（如2050分钟），待鼠尾胶原被消化到肉眼不可见而释放出组织时，终止消化并用基础培养基洗涤。然后按一定比例（如1:31:5）种入新制作的气液交互培养系统中进行传代。

进行第一次传代后，依据样本类器官生长情况每隔一定时间（如3~10天）进行一次传代。

每次消化得到的已长成的类器官可以用冻存液重悬后冷冻保存，以便后续使用。

四、关键要点

鼠尾胶原溶液的配制：在冰浴下，向大鼠I型鼠尾胶原中加入适量的培养基和其他成分（如4-羟乙基哌嗪乙磺酸、NaOH、NaHCO3及双蒸水等），使鼠尾胶原溶液的终浓度达到适当水平（如2.5mg/mL）。

新鲜离体的膀胱癌组织的处理：将获得的新鲜离体膀胱癌组织修剪去除非肿瘤组织及明显的坏死组织后，用预冷的含双抗的PBS冲洗若干遍。然后在无菌环境下切碎至直径小于0.1mm（即肉糜状），再用细胞筛网过滤并离心洗涤。

培养条件的控制：在培养过程中需要严格控制培养条件，如温度（37℃）、湿度、气体环境（如5% CO2）等，以确保膀胱癌细胞的正常生长和分化。

此外，值得注意的是，该方法通过创造性地采用气液交互培养系统进行膀胱癌类器官的体外培养，使包裹在胶质里的肿瘤细胞充分接触空气，避免了类器官在培养过程中容易缺氧的情况，而且明显提高了细胞活性，使膀胱癌类器官的培养成功率得到显著提高。同时，该方法在样品准备时不需要经过酶消化步骤，简化了操作并减少了细胞损失。

总结

体外培养膀胱癌类器官的方法需要精细的操作和严格的培养条件控制。通过该方法可以成功培养出具有生物学功能和结构特征的膀胱癌类器官，为膀胱癌的研究和治疗提供有力的工具。