通过三维培养体系调控肿瘤微环境，需从细胞组成、物理结构、化学信号及动态交互四个维度综合设计，以模拟体内肿瘤的复杂生态。以下是具体策略与技术路径：
一、多细胞类型共培养：重构肿瘤异质性
1.核心细胞组合
肿瘤细胞：选择患者来源的肿瘤干细胞（CSCs）或诱导多能干细胞（iPSCs）分化的肿瘤细胞，保留原始肿瘤的遗传异质性。
基质细胞：
癌症相关成纤维细胞（CAF）：分泌IL-6、TGF-β等因子，促进肿瘤干细胞自我更新和侵袭性。
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）：通过M2型极化分泌IL-10、EGF，抑制免疫应答并促进血管生成。
内皮细胞：形成血管网络，模拟肿瘤内营养供应与代谢废物排出。
免疫细胞：引入T细胞、NK细胞或CAR-T细胞，构建免疫微环境，研究免疫逃逸机制。
2.共培养策略
分层接种：先铺Matrigel基质，再依次接种CAF、内皮细胞，最后覆盖肿瘤细胞，形成空间分层结构。
混合接种：将肿瘤细胞与CAF按1:1比例混合后嵌入基质胶，促进细胞间直接接触。
动态灌注：结合微流控芯片实现培养基持续流动，模拟体内血液灌注，维持细胞活性。
3.功能验证
侵袭性评估：通过Transwell实验检测共培养后肿瘤细胞的迁移能力。
血管生成检测：使用CD31抗体标记内皮细胞，量化血管网络密度与分支长度。
免疫响应分析：流式细胞术检测T细胞活化标志物（如CD69、IFN-γ）表达水平。
二、基质胶与生物材料优化：模拟细胞外基质（ECM）
1.基质胶成分调整
硬度调控：通过调整Matrigel浓度（2-10 mg/mL）改变基质硬度，模拟正常组织（0.5-1 kPa）与肿瘤组织（10-50 kPa）的力学差异。
功能化修饰：
掺入RGD肽序列增强细胞黏附。
添加透明质酸（HA）或胶原蛋白IV，模拟肿瘤ECM的组成复杂性。
降解性控制：引入光交联或酶敏感基团，实现基质动态重塑，模拟体内ECM降解过程。
2.新型生物材料应用
水凝胶体系：
聚乙二醇（PEG）水凝胶：通过化学交联调节孔径（50-200 μm），控制营养扩散速率。
海藻酸钠水凝胶：结合Ca²⁺交联实现可注射性，适用于原位肿瘤模型构建。
3D打印支架：
使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）打印多孔支架（孔径100-300 μm），提供结构支撑并引导细胞定向生长。
负载生长因子（如EGF、VEGF）实现局部缓释，模拟旁分泌信号梯度。
三、化学信号调控：模拟肿瘤微环境因子网络
1.关键因子添加
促炎因子：IL-6（50 ng/mL）、TNF-α（20 ng/mL）激活NF-κB通路，促进肿瘤细胞增殖与存活。
生长因子：EGF（50 ng/mL）、HGF（20 ng/mL）驱动肿瘤干细胞自我更新。
代谢物：乳酸（10 mM）模拟肿瘤酸性微环境，诱导TAM向M2型极化。
缺氧模拟：通过化学缺氧剂（如CoCl₂，100 μM）或低氧培养箱（1% O₂）激活HIF-1α通路，促进血管生成与代谢重编程。
2.动态信号调控
微流控芯片控制：通过多通道泵实现因子浓度梯度（如0-100 ng/mL VEGF梯度），模拟体内旁分泌信号分布。
光控释放系统：将生长因子包裹在光敏脂质体中，通过近红外光触发释放，实现时空精准调控。
反馈调节回路：结合传感器细胞（如表达荧光报告基因的HEK293细胞）实时监测因子浓度，并通过微泵自动调整添加量。
四、物理微环境调控：力学与拓扑结构影响
1.基质硬度调节
软基质（0.5-1 kPa）：模拟正常组织，抑制肿瘤细胞侵袭。
硬基质（10-50 kPa）：模拟肿瘤组织，通过YAP/TAZ通路激活促癌基因表达。
硬度梯度：构建从软到硬的基质梯度，诱导肿瘤细胞定向迁移（类似趋触性）。
2.拓扑结构设计
微沟槽：在基质表面刻蚀宽度5-20 μm的沟槽，引导肿瘤细胞沿沟槽定向排列，模拟体内组织纤维走向。
纳米图案化：通过电子束光刻制备纳米柱阵列（直径100 nm，间距200 nm），调控细胞膜受体分布与信号转导。
3D孔隙结构：使用盐析法或气体发泡法制备多孔支架（孔径50-200 μm），促进细胞浸润与营养交换。
3.流体剪切力模拟
层流剪切：在微流控芯片中设置流速0.1-1 dyn/cm²的层流，模拟肿瘤内间质液流动，影响细胞形态与基因表达。
湍流剪切：通过障碍物设计产生湍流（流速>10 dyn/cm²），模拟血管内血流冲击，研究肿瘤细胞机械转导机制。
五、动态监测与反馈调控
1.实时成像技术
共聚焦显微镜：观察细胞间相互作用（如CAF与肿瘤细胞的突触连接）。
光声成像：监测血管生成过程中的血氧饱和度变化。
拉曼光谱：无标记检测细胞代谢物（如乳酸、谷氨酰胺）分布。
2.AI辅助分析
深度学习模型：训练卷积神经网络（CNN）自动识别类器官形态变化（如褶皱形成、空腔扩张）。
多组学整合：结合转录组、蛋白组与代谢组数据，构建肿瘤微环境调控网络图谱。
3.闭环反馈系统
硬件层：微流控芯片、微泵、传感器集成化设计。
软件层：通过Python脚本实现数据实时采集与因子浓度动态调整。
应用案例：MIT开发的“肿瘤芯片”系统，可自动维持类器官生长所需的O₂、CO₂与pH值，并实时反馈调整培养基成分。
