在模拟微重力回转仪中培养卵巢癌类器官，需结合三维培养技术、微重力模拟设备特性及类器官培养规范，从设备选择、培养体系优化、实验操作及生物学分析四个方面进行系统设计，具体要点如下：

一、设备选择与参数校准

1.回转仪类型与性能

旋转壁生物反应器（RWV）：通过水平旋转实现离心力与重力平衡，模拟微重力环境（10⁻³g至10⁻⁶g），适用于长期培养（数周至数月）。例如，北京基尔比生物公司的Kilby Gravite系统支持两轴旋转，可精确控制微重力水平。

随机定位仪（RPM）：通过双轴随机旋转快速改变重力矢量方向，平均净重力趋近于零，适用于短期实验（如细胞信号通路研究）。

关键参数：转速需低速设置（如1-4rpm）以避免剪切力干扰，同时需实时监测重力数值（精度±0.001G）确保环境稳定。

2.培养容器适配性

使用透气性硅胶膜或中空纤维结构的培养瓶，支持气体交换并减少流体剪切力（<0.1 dyne/cm²），保护敏感细胞（如干细胞、肿瘤细胞）。

定制化支架或转壁式EP管生物反应器，适用于悬浮或贴壁细胞培养，需确保培养基充注量避免旋转时溢出。

二、培养体系优化

基质胶与细胞悬液混合

基质胶选择：使用Matrigel或合成聚乙二醇基质，需在4℃下过夜解冻，并按7:3体积比与细胞悬液混合，避免产生气泡。

细胞密度优化：初始接种密度需调整至5,000-10,000个细胞/μL，避免过高导致营养不足，过低抑制3D聚集体形成。例如，卵巢癌类器官培养中，将细胞悬液调整至5000个细胞/μL可显著提高类器官形成率。

培养基配方与动态灌注

基础培养基：DMEM/F12补充10% FBS、1× L-glutamine、1× N2、1× B27、50 ng/mL EGF、100 ng/mL Noggin、50 ng/mL R-spondin 1等生长因子。

动态灌注系统：结合微流控芯片实现营养/氧气动态供应，避免微重力下液体分层导致的代谢废物积累。例如，每2-3天更换培养基，并补充抗氧化剂（如NAC）以应对氧化应激。

三、实验操作规范

1.样本采集与处理

样本来源：手术组织（首选）、腹水/胸腔积液或穿刺活检组织，需经病理鉴定且肿瘤细胞含量≥10%。

无菌操作：组织离体后10分钟内浸入保存液，全程密封运输至实验室，避免污染。

组织消化：使用胶原酶IV（1 mg/mL）和脱氧核糖核酸酶（0.2 mg/mL）在37℃下解离1-2小时，每隔20分钟机械吹打促进解离。

2.接种与固化

种板技术：将20 μL混合液接种于预热的48孔板中心，避免接触侧壁，倒置培养箱中孵育10-20分钟使Matrigel固化。

培养基添加：固化后缓慢滴加250 μL预热培养基，确保基质胶被完全覆盖，减少边缘效应。

四、生物学分析与质量控制

1.形态学与功能验证

显微镜观察：使用相差显微镜或共聚焦显微镜评估类器官形态（致密型、囊泡型、混合型）和完整性，活率需≥50%。

免疫组化与基因检测：通过HE染色验证核深染、异常分裂象等肿瘤特征，短串联重复序列（STR）检测确认类器官与原肿瘤组织遗传一致性。

2.微重力效应评估

细胞骨架分析：定量分析微管重组和F-actin分布变化，揭示微重力对细胞力学特性的影响。

信号通路调控：通过RNA-seq检测差异基因（如整合素、HIF-1α通路），蛋白组学验证关键通路（如NF-κB、MAPK）活性变化。

总结

模拟微重力回转仪中卵巢癌类器官培养需调控转速以平衡微重力效应与剪切力，采用三维基质支撑，优化含 EGF 等因子的培养基，维持适宜温 pH。需监测形态、增殖及 CA125 等标志物，难点在结构稳定性及肿瘤异质性保留。